Ureasa

Introducción

La ureasa, cuyo nombre sistemático es amidohidrolasa de urea, tiene un peso molecular de 483 000 Dalton. La ureasa consta de 6 subunidades estructurales iguales. Es una enzima muy específica, que existe en varios tipos de vegetales, por ejemplo, en el frijol de soya. La ureasa se utiliza mucho como agente catalítico para la medición cuantitativa de urea. El hidróxido de amonio que se forma puede titularse y puede relacionarse, estequiométricamente, con la cantidad de urea presente en una muestra. Aunque la ureasa no es muy común en la naturaleza, esta enzima ha tenido más importancia en el desarrollo de la enzimología moderna que ninguna otra. Las investigaciones sobre la ureasa han permitido deducir el principio importante en las reacciones enzimáticas: la función de los grupos SH (sulfhídrico) en la catálisis. La ureasa posee 3 o 4 grupos activos, es una representante de un gran número de enzimas cuya actividad depende de la existencia de grupos SH, intactos, procedentes de cisteínas que forman parte de la cadena poli peptídica de la enzima.  (1)

Reacción catalizada por la ureasa:

La ureasa, de acuerdo con la clasificación internacional de enzimas, pertenece al grupo de las hidrolasas  un ejemplos es el anterior.

Indicador de pH: Rojo fenol, a) acido: color amarillo, pH 6.8 b) alcalino: color rosado rojo, pH 8.4 El indicador de iones hidrogeno rojo fenol muestra la producción de ureasa por los miembros de la subfamilia Proteeae mediante la demostración disminuida de la concentración de iones hidrogeno a causa de la formación de dos moléculas de amoniaco. (2)

Para inhibir la acción de la ureasa, se utiliza el cloruro de mercurio (II). En el sitio catalítico, la ureasa presente presenta grupos –SH (sulfhídrico), provenientes del aminoácido cisteína que forma parte de su cadena peptídica. El cloruro de mercurio se une irreversible a los grupos –SH, los inactiva y así, se detiene la actividad enzimática de la ureasa.

Fundamentos

Las enzimas son proteínas que aceleran la velocidad de la reacción química en nuestro organismo, con excepción de los ribozimas (que son polinucleótidos con actividad catalítica). La actividad enzimática, definida como cantidad de producto formado o cantidad de sustrato degradado por unidad de tiempo, es afectada por una serie de factores tales como:

·         Temperatura

·         La pH

·         La concentración de sustrato

·         La concentración de enzima

A)     Efecto de la temperatura sobre la actividad de la ureasa

Para toda enzima una temperatura optima de actividad, a la cual la velocidad de reacción es máxima. A temperaturas debajo de esta  temperatura, la frecuencia de choques entre la enzima y el sustrato es baja y, por tanto, la velocidad de reacción también lo es. Conforme se incrementa la temperatura, aumenta la frecuencia de choques y se favorece la velocidad de reacción ( la formación del producto). Pero si la temperatura es muy elevada, pueden romper la estructura de Vander Waals y los puentes de hidrogeno que estabilizan la estructura terciaria y cuaternario de las enzimas, como consecuencia, se produce su desnaturalización y la perdida de la actividad enzimática.

B)      Efecto de la pH sobre la actividad de la ureasa

La estructura  tridimensional de una enzima de origen proteico determina su sitio catalítico y, por lo tanto, su actividad. Dicha estructura se encuentra estabilizada por una serie de enlaces no covalentes (hidrofóbicos, puentes de hidrogeno, atracciones electrostáticas) y covalentes (puentes de disulfuro)  que existen entre los grupos  R de los aminoácidos que no son neutros ( como el aspartato, la lisina, la arginina y el glutamato), e interfieren con las atracciones electrostáticas y su estabilidad estructural tridimensional, lo que provoca una pérdida total o parcial de la actividad enzimática.

Para cada enzima existe un pH óptimo en relación con la actividad, el cual varía según la región celular en que se encuentre dicha enzima: por ejemplo, el pH dentro del lisosoma o en el estómago es alrededor de 2 (y ese es el pH óptimo de las enzimas allí localizadas), mientras que las enzimas presentes en el plasma o en el duodeno tienen un pH óptimo de actividad entre 7.0 y 8.0

La ureasa actúa en los compuestos a nivel de los puentes C-N excepto en aquellos que contiene puentes peptídicos. El pH óptimo para la actividad de la ureasa es de 7. (3)

C)      Efecto del tiempo de reacción en la cantidad de urea hidrolizada

En toda reacción enzimática, la enzima no es consumida ni sufre modificación alguna, de manera que puede continuar transformando otra molécula de sustrato en producto. Por lo tanto, si se garantiza que la concentración de sustrato no será un elemento limitante (es decir, que no se agotará), a mayor tiempo de reacción, mayor será la formación del producto o de la degradación del sustrato.

D)     Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática

En todas reacciones enzimáticas, si se incrementa la concentración de enzima, se forma mayor cantidad de productos por unidad de tiempo. EL incremento en la velocidad de reacción es directamente proporcional al incremento en la concentración de enzima, siempre y cuando la cantidad de sustrato no sea limitante, es decir, que el sustrato no llegue a agotarse.

Metodología

Para el estudio de la ureasa toda la cristalería se empapó con solución KI al 15%  y enjuagó con agua desionizada. 

Se rotulo 4 tubos de ensaye con los números 1 al 4, se agregó a cada uno las cantidades del siguiente esquema

REACTIVO	TUBO #1	TUBO #2	TUBO #3	TUBO #4
UREA al 10%	3 ml	3 ml	3 ml	---
Rojo fenol al 1%	3 gotas	3 gotas	3 gotas	3 gotas
AgN al 1%	---	2 gotas	---	---
Pb(N al 15%	---	---	2 gotas	---
Agua destilada	---	---	---	3 ml
Ureasa al 1%	1 ml	1  ml	1  ml	1  ml

Se agito perfectamente, posteriormente se dejó reposar a temperatura ambiente.

Se observó  a los minutos “2,5 y 10” a cada uno de los tubos. Posteriormente se anotaron los resultados en una tabla describiendo el color que se obtuvo en cada caso indicando cuando ya no se producía color.

Se  agregó 1 ml de agua saturada de ácido sulfhídrico al tubo #2. Se dejó reposar por 5 minutos y se anotó lo observado.

Se colocó 1 ml de Hg(NO3)2 al 5% en un tubo de ensañe nuevo y se dejó pasar 3 minutos. Se desechó y se enjuagó únicamente una vez con agua destilada. Se agregó a cada uno las cantidades del siguiente esquema

REACTIVO	Tubo de ensañe nuevo
UREA al 10%	3 ml
Rojo fenol al 1%	3 gotas
AgN al 1%	---
Pb(N al 15%	---
Agua destilada	---
Ureasa al 1%	1 ml

Se dejó reposar 10 minutos y se anotaron los resultados en una tabla describiendo el color que se obtuvo en cada caso indicando cuando ya no se producía color.

Posterior se efectuó el mismo procedimiento, lavando con KI al 15% en lugar de agua destilada y se apuntaron los resultados.   (3)

Fuentes bibliográficas

        I.            Química de Alimentos: Manual de laboratorio Nuria Bolaños V., Giselle Lutz C., Carlos H. Herrera R. - 2003 paginas(49-50)

      II.            Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica.  By Silvia Quesada Mora paginas 35-37

    III.            Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica  By Jean F. MacFaddin paginas (398 y 399)