Glosario de proteínas

Absorbancia.cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra. Está definida como:

siendo la intensidad después de haber habido la absorción e la intensidad de la luz que se hace incidir en la muestra.

Albumina de suero bovino (BSA). Sustancia  purificada  ideal para las aplicaciones industriales y de investigaciones las cuales requieren una proteína de alta pureza y baja en endotoxinas, libre de acido graso, y de IgG, libre de proteasas y libre de virus bovino.

Catalizador. Sustancia química, simple o compuesta, que modifica la velocidad de una reacción química, interviniendo en ella pero sin llegar a formar parte de los productos resultantes de la misma, se caracterizan con arreglo a las dos variables principales que los definen: la fase activa y la selectividad. La actividad y la selectividad, e incluso la vida misma del catalizador, dependen directamente de la fase activa utilizada.

Cinética enzimática. Estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas.

Coeficiente de partición.  Cociente o razón entre las concentraciones de esa sustancia en las dos fases de la mezcla formada por dos disolventes inmiscibles en equilibrio. Por tanto, ese coeficiente mide la solubilidad diferencial de una sustancia en esos dos disolventes.

Donde: [sustancia]₁ es la concentración de la sustancia en el primer disolvente y, análogamente [sustancia]₂ es la concentración de la misma sustancia en el otro disolvente.

Cromatografía. Método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas. Conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Las técnicas cromatográficas consisten en la utilización de una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

• Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
• Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.
•  

Cromatografía de afinidad  o  inmunoafinidad. Método que emplea esferas  de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas, que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja, o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen.

Cromatografía de filtración en gel. Técnica que permite separar moléculas en función de su tamaño molecular. La capacidad separadora reside fundamentalmente en el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamaño de sus poros.

Cromatografía De Intercambio Iónico. Método cromatográfico predominante utilizado en la producción de macromoléculas biológicas. Está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto.

Electroforesis. Método en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. Fundamento. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas  en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir  cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).


Electroforesis gel de. Consiste en un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz  que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido.

	fig. Fragmentos de ADN teñidos en bromuro de etidio tras una electroforesis en un gel de agarosa.

 

Enzimas. moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas.

 En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas.

fig. Estructura de la triosafosfato isomerasa. Conformación en forma de diagrama de cintas rodeado por el modelo de relleno de espacio de la proteína. Esta proteína es una eficiente enzima involucrada en el proceso de transformación de azúcares en energía en las células.

Debido a que las enzimas son extremadamente selectivas con sus sustratos y su velocidad crece sólo con algunas reacciones, el conjunto (set) de enzimas sintetizadas en una célula determina el tipo de metabolismo que tendrá cada célula. A su vez, esta síntesis depende de la

regulación de la expresión génica.

Espectrofotometría método de análisis óptico que fundamenta que todas las sustancias pueden absorber energía radiante. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

La espectrofotometría ultravioleta-visible usa haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800 nm , por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro.

Al campo de luz uv de 200 a 400 nm se le conoce también como rango de uv cercano , la espectrofotometría visible solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible , de 400 a 800 nm.

Fig. Estructura cuaternaria de la LDH (lactato deshidrogenasa) tetrámero M4

Lactato deshidrogenasa. Enzima catalizadora que corresponde a la categoría de las oxidorreductasas, en la que el piruvato es reducido a lactato debido a la oxidación de NADH a NAD⁺. La lactato deshidrogenasa (140 kDa) está formada por 4 subunidades, cada una de unos 35 kDa. Se conocen dos tipos de subunidades: H y M, que presentan pequeñas diferencias en su secuencia de aminoácidos. Ambas pueden asociarse independientemente para formar tetrámeros, dando lugar a cinco isoenzimas (isoformas de la enzima), correspondientes a las cinco combinaciones posibles, cada una de las cuales se encuentra preferentemente en determinados tejidos y puede identificarse

mediante electroforesis. La lactato deshidrogenada de músculo

se encuentra formada por 4 subunidades M y es conocida como la LDH-5 (M4).

Ley  de Lambert –Beer. relación empírica que relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado.

Relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción. La relación entre ambas intensidades puede expresarse a través la siguiente relación:

En la que:

I₁  I₀ son las intensidades saliente y entrante respectivamente; a es el coeficiente de absorción, l es la longitud atravesada por la radiación, c es la concentración del medio.

Peso molecular. Masa total de los protones y neutrones en un átomo único en estado de reposo.

Precipitación por salado método de separación de proteínas de su estado natural (actividad biológica).El sulfato de amonio es una de las sales más utilizadas para la precipitación salina de proteínas.  Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20°C, temperatura promedio del laboratorio) y el ión sulfato divalente permite  alcanzar altas fuerzas iónicas.  En esta determinación la proteína blanca del huevo (clara) será separada en fracciones de globulina y albúmina.

Proteína. Molécula orgánica compuesta por una sola cadena polipeptídica; en tal caso reciben el nombre de manométricas. Cuando la proteína está formada por varias cadenas polipeptídicas que pueden o no ser idénticas entre sí, reciben el nombre de oligoméricas. Poseen pesos moleculares elevados. Todas producen por hidrolisis µ -aminoácidos.

Proteína composición de las. Las proteínas preincipalmente están compuestas de :

·         Carbono

·         Hidrógeno

·         Nitrógeno

·         Oxígeno

Y otros elementos tales como:

• Azufre                                                                                 
• Hierro
• Fósforo
• Cinc

fig. Desnaturalización reversible de una ribonucleasa (1) y renaturalizacion (2)

Proteína desnaturalización de las. Modificaciones  en la estructura de la proteína que traen como resultado una alteración o desaparición de sus funciones. Puede producirse por una factores físicos cómo : el calor, las radiaciones ultravioleta, las altas presiones; o químicos cómo : ácidos, bases, sustancias con actividad detergente.
Este fenómeno genera la ruptura de los enlaces disulfuro y los puentes de hidrógeno, generando la exposición de estos.
Cuando la proteína es desnaturalizada pierde sus funciones cómo: viscosidad, velocidad de difusión y la facilidad con que se cristalizan.
La reversibilidad de la desnaturalización, depende que tan fuertes sean los agentes que desnaturalizaron la proteína.

Proteína Estructura de las. de acuerdo a la estructura de las proteínas estas pueden clasificarse en :

·      Estructura Primaria : Es el esqueleto covalente de la cadena polipeptídica, y establece la secuencia de aminoácidos.  Rige el orden de encadenamiento por medio del enlace polipeptídico.

·                Estructura Secundaria : Ordenación regular y periódica de la cadena polopeptídica en el espacio.Rige el arreglo espacial de la cadena polipeptídica en el espacio.

Arreglos: Hélice-a , Hélice-b , Hélice Colágeno.

·                            Estructura Terciaria: Forma en la cual la cadena polipeptídica se curva o se pliega para formar estructuras estrechamente plegadas y compactas como la de las proteínas globulares.

 

 Rige el arreglo tridimensional en el cual participan las atracciones intermoleculares. (Fuerzas de Van der Walls, Puentes de Hidrógeno, Puentes disulfuro, etc)

·                    Estructura Cuaternaria : Es el arreglo espacial de las subunidades de una proteínas, para conformar la estructura global.
Es el acompañamiento paralelo de las cadenas polipeptídicas, responsable de las funciones de las proteínas.

·                   

Proteína purificación de. Aislamiento de la molécula que  permite estudiar tanto su actividad enzimática como la función específica que desempeña en la célula o tejido de donde se aisló.

Punto isoeléctrico. es el pH al que una sustancia anfótera tiene carga neta cero. En moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es prácticamente nulo, se le denomina punto isoeléctrico.

salting in. Fenómeno por el cual la concentración de sal aumenta la solubilidad de la proteína por la concentración de iones en el medio.

Salting out. precipitación de una proteína por saturación de la solución con sales neutras

Técnica de Bradfor  procedimiento simple para la determinación de la concentración de la proteína en soluciones Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

Técnica de Lowry: método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color de la disolución resultante proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert‑Beer (ver apartado de fotometría).

            Este método consta de dos etapas:

1)  

Los iones Cu²⁺, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de

nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu²⁺-

proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu²⁺ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

2)  La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina  presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin‑Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Técnica de Biuret:reacción que se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu²⁺ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico.

1Cu²⁺ se acompleja con 4 NH y la intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren.

La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

Velocidad de reacción relación de el cambio en la concentración de reactivos o productos con el tiempo expresado, usualmente, en mol/l × s.  Se establece midiendo la variación de la concentración de los reactivos o de los productos con el tiempo. Si se selecciona un producto, la expresión de la velocidad tiene signo positivo, ya que la variación de su concentración siempre es positiva.

TIPOS DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA

TIPOS DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA

-Catálisis electrostática

Las cargas positivas y negativas pueden ser estabilizadas por la presencia de iones del signo contrario en un proceso que se denomina catálisis electrostática. La estabilización puede ser por residuos en el sitio activo de la formación de enlaces iónicos con el intermediario, estos enlaces pueden venir de cadenas laterales ácidas o básicas presentes en  aminoácidos como arginina, lisina o acido glutámico o venir de cofactores metálicos como el Zinc, siendo estos últimos más eficaces pues pueden reducir el pKa del agua lo suficiente para volverlo un efectivo nucleófilo.

Para lograr eso, en el momento que un substrato se une al enzima, el agua es usualmente excluida del sitio activo causando que la constante dieléctrica disminuya, con valores similares a la de un solvente orgánico, dando como resultado que las interacciones electrostáticas aumenten significativamente. La distribución de cargas en estos medios puede tener gran efecto en la reactividad química y por tanto, en la velocidad de las reacciones. [1]

A pesar de que la evidencia experimental y teórica es muy escasa en este tema, hay indicios que demuestran que las distribuciones de cargas cerca de los sitios activos ayudan a estabilizar los estados de transición de las reacciones catalizadas, este modo de incremento de velocidad se asemeja a la forma de catálisis por iones metálicos, además, en varios enzimas, estas distribuciones de cargas sirven para guiar los substratos polares hacia sus lugares de unión, de modo que la velocidad de las reacciones es mayor a que si fueran controladas por difusión. [2]

Un ejemplo de esto es la Carboxipeptidasa que en su C.A. presenta un átomo de Zn cuya misión es la de polarizar en enlace C=O con sus dos cargas positivas, lo que genera una atracción muy significativa de los electrones del oxígeno, que a su vez arrastrará a los del doble enlace, haciendo más electrofílico al carbono para que actúe con más facilidad en agua como nucleófilo. [3]

- Catálisis por efecto de la aproximación y orientación.

La combinación de los factores de proximidad y orientación favorable de los sustratos sobre el centro activo explica por sí misma los incrementos de velocidad observados en algunas reacciones catalizadas enzimáticamente. Sin embargo, los enzimas todavía pueden utilizar la energía de fijación de un modo adicional para producir catálisis, a saber, provocando en la(s) molécula(s) de sustrato una distorsión favorable para que se alcance con prontitud el estado de transición.

Si bien las enzimas emplean mecanismos catalíticos que se asemejan a los de las reacciones con modelo orgánico, desde el  punto de vista catalítico son mucho más eficaces que estos modelos.

Esta eficacia debe originarse en las condiciones físicas específicas en los sitios catalíticos de la enzima que estimulan las reacciones químicas correspondientes. Los efectos más obvios son proximidad y orientación; para que una reacción se produzca, los reactantes deben tener la relación espacial adecuada.

a)    La proximidad sola contribuye relativamente poco a la catálisis

Estas reacciones aumenta la velocidad de la reacción como las interacciones enzima-sustrato alinean grupos químicos reactivos y los mantienen juntos. Esto reduce la entropía de los reactivos y por lo tanto hace que las reacciones tales como las ligaduras o reacciones de adición sean más favorables, hay una reducción en la pérdida total de la entropía cuando dos reactivos se convierten en un solo producto.

Este efecto es análogo a un incremento efectivo en la concentración de los reactivos. La unión de los reactivos de la enzima da el carácter reacción intramolecular, lo que da un aumento de la tasa masiva.

Sin embargo, la situación puede ser más compleja, ya que los estudios computacionales modernos han establecido que los ejemplos tradicionales de los efectos de proximidad no sepueden relacionar directamente con los efectos entrópicos de las. También  se ha encontrado la propuesta original entrópica a sobreestimar en gran medida la contribución de la orientación de la entropía a la catálisis.

b)    Los reactantes orientados de manera adecuada y la detención de sus movimientos relativos pueden producir grandes intensificaciones de la velocidad catalítica.

El efecto de orientación tiene en cuenta la orientación/disposición espacial de las sustancias reaccionantes, es decir de la enzima (centro activo) y del sustrato(s). Koshland, tras el estudio detallado de estos efectos, llegó a la conclusión de que, en el caso de las enzimas, son éstas, las enzimas, las que orientan y aproximan los grupos reactivos, pero que además hay que tener en cuentaun tercer efecto. Koshland parte de la hipótesis de que, además de los efectos de orientación y aproximación de los grupos reactivos, existe otro efecto, más fino, consistente en la orientación de los orbitales electrónicos de los grupos reaccionantes, permitiendo un solapamiento máximo entre ellos. Con modelos sacados de la Química Orgánica, Koshland estudió el efecto de aproximación de una serie de reacciones de esterificación intramoleculares.

Koshland, observó que la velocidad de reacción era diferente según las posibilidades de giro que tenían los grupos reactivos de la molécula. La velocidad de reacción era mayor (è la reacción está favorecida) a medida que disminuía el número de orientaciones posibles, es decir a medida que disminuían los grados de libertad, Ante estos datos Koshland dedujo que además de los efectos de orientación general y acercamiento, -que están presentes en todas las reacciones intramoleculares- debía haber otro efecto de orientación debido a la limitación de giro de los grupos reaccionantes. Todo esto hizo proponer a Koshland la siguiente hipótesis para una reacción enzimática (catalizada por una enzima).

Según Koshlandla eficiencia catalítica de las enzimas depende de su habilidad, no sólo para atraer y yuxtaponer los grupos reaccionantes, sino también de orientar los orbitales, de los átomos implicados, de manera tal que el solapamiento es máximo. La enzima favorece este tipo de solapamiento, orientando los correspondientes orbitales. [4]

-Catálisis por fijación preferencial del estado de transición

En esencia, los enzimas catalizan las reacciones mediante la estabilización de los estados de transición que son las especies químicas de energía más alta generadas con las reacciones. Con esta estabilización selectiva de un estado de transición, un enzima determina cuál de las distintas reacciones químicas potenciales va a tener lugar. 

Las intensificaciones de la velocidad efectuadas por las enzimas a menudo son mayores que las que pueden considerarse por los mecanismos catalíticos descritos hasta ahora. Sin embargo, aún no consideramos unos de los mecanismos más importantes de la catálisis enzimática: la fijación del estado de transición a una enzima con afinidad mayor que los sustratos o productos correspondientes. Cuando se consideran junto con los mecanismos catalíticos descritos antes, la fijación preferencial del estado de transición racionaliza las velocidades observadas de las reacciones enzimáticas.

El concepto original de fijación del estado de transición propuso que las enzimas fuerzan en forma mecánica a sus sustratos hacia la geometría del estado de transición a través de los sitios de unión en los que los sustratos sin distorsión no encajan de manera adecuada. Este es el denominado mecanismo de potro (de estiramiento “rack”, en analogía con el dispositivo de tortura medieval) basado en la evidencia extensa del papel de la tensión en la estimulación de las reacciones orgánicas. Por ejemplo, la velocidad de la reacción, 

Es 315 veces más rápida cuando R es CH₃ en lugar de H, debido a las repulsiones estéricas mayores entre los grupos CH₃ y los grupos reactantes. De manera similar, las reacciones de apertura de los anillos son considerablemente más fáciles para los anillos con tensión como ciclopropano que para los anillos sin tensión como el ciclohexano.

En cualquier proceso, el reactante con tensión se asemeja más al estado de transición de la reacción con el reactante correspondiente sin tensión. Así, como lo sugirió por primera vez Linus Pauling y luego ampliaron Richard Wolfenden y Gustav Lienhard, las interacciones que fijan en forma preferencial el estado de transición incrementan su concentración y por consiguiente aumentan de manera proporcional la velocidad de la reacción. [5]

Ecuación del estado de transición

Los enzimas aceleran las reacciones estabilizando los estados de transición.

Una reacción química que transforma el sustrato S en producto P transcurre a través de un estado de transición S^‡ que tiene mayor energía libre que S o P.

V

K‡

 

S              S^‡          P

El estado de transición corresponde a la especie molecular que dura menos tiempo en la reacción, debido a que presenta la mayor energía libre. La energía libre de activación de Gibbs, simbolizada por ∆G^‡, es igual a la diferencia en energía libre entre el estado de transición y el sustrato. El símbolo (‡) indica una cantidad termodinámica del estado de transición.

∆G^‡= G_S^‡-G_S

La velocidad de reacción V es proporcional a la concentración de S‡, que depende de ∆G^‡, porque está en equilibrio con S.

[S^‡]= [S]e^-∆G‡/RT

V= v[S^‡] = [S]e^-∆G‡/RT

En estas ecuaciones k es la constante de Boltzmann y h es la constante de Planck.

Análogos de estado de transición

Los químicos a menudo aprovechan el conocimiento del estado de transición de una reacción catalizada por enzima para diseñar  y crear inhibidores de enzima más eficaces, llamados análogos de estado de transición, como farmacóforos potenciales.

La racemización de la prolina tiene lugar a través  de un estado de transición en el que el átomo de carbono α tetraédrico se convierte en trigonal por la pérdida de un protón. En esta forma trigonal, sus tres enlaces están en el mismo plano; C_α también posee una carga neta negativa este carboanión simétrico puede desprotonarse tanto por un lado, para originar el isómero L, como por el otro lado, originando el isómero D. este supuesto se confirmo cuando se comprobó que el pirrol-2-carboxilato se une a la racemasa con una fuerza 160 veces mayor que la propia prolina. El carbono α de este inhibidor es trigonal como el del estado de transición. Se podría esperar que cualquier análogo que tuviera una carga negativa en el C_α fuera capaz de unirse mas fuertemente aun, pero no ha sido posible sintetizar ningún compuesto de este tipo que resultase estable. En general, se pueden producir inhibidores de enzimas con alta potencia y especificidad mediante la síntesis de compuestos semejantes al estado de transición que sufre el sustrato. El poder de inhibición de los análogos del estado de transición hace evidente la esencia misma de la catálisis: la unión selectiva del estado de transición a la enzima. [6]

Complejo Nitrogenasa

Reacciones de transferencia de electrones en las mitocondrias

Reacciones de transferencia de electrones en las mitocondrias

El descubrimiento de Eugene Kennedy y Albert Lehninger en 1948  de que la mitocondria es el sitio en donde se realiza las fosforilación oxidativa en los eucariotas marcó el inicio de la fase moderna sobre las transducciones biológicas de energía. Las mitocondrias, al igual que las bacterias gram-negativas tienen dos membranas. La membrana mitocondrial externa es fácilmente permeable a pequeñas moléculas e iones, que se mueven libremente a través de canales trasmembrana compuestos por una familia de proteínas integrales de membrana llamadas porinas. La membrana interna es impermeable a la mayoría de moléculas pequeñas e iones, incluido el protón, las unidades especies que cruzan esta membrana lo hacen a través de transportadores específicos. La membrana interna aloja los componentes de la cadena respiratoria y ATP sintasa. La matriz mitocondrial, el espacio de la piruvato deshidrogenasa y los enzimas del ciclo cítrico, de la ruta de la beta-oxidación de los ácidos grasos y de las rutas de oxidación de combustibles excepto la glucolisis, que tiene lugar en el citosol. Debido a que la membrana interna tiene una permeabilidad selectiva, separa los intermediarios y enzimas de las rutas metabólicas citosólicas de los procesos metabólicos que se producen en la matriz. Sin embargo, el pirúvico, los ácidos grasos y aminoácidos o sus derivados alfa-ceto son llevados por transportadores específicos a la matriz para poder acceder a la maquinaria del ciclo del ácido cítrico. El ADP y el Pi son transportados específicamente al interior de la matriz al mismo tiempo que el recién sintetizado ATP es trasportado al exterior.

La mitocondria está formada por cuatro subregiones diferentes: la membrana externa, la membrana interna, el espacio intermembrana y la matriz, situada dentro de la membrana interna. La membrana interna está muy plegada, formando crestas que se proyectan hacia el interior de la mitocondria y que, a menudo, llegan casi hasta el otro lado de la misma. Dado que las proteínas respiratorias están unidas a la membrana interna, la densidad de las crestas esta relacionada con la actividad respiratoria de la célula.

Visión general de la fosforilación oxidativa

Sea cual sean el compartimiento en el que se produzca las oxidaciones biológicas todos estos procesos generan transportadores electrónicos reducidos, fundamentalmente NADH. La mayor parte de este NADH se reoxida, con la producción simultánea de ATP por las enzimas de la cadena respiratoria, que están fermenten embebidas en la membrana interna.

Los transportadores electrónicos reducidos, producidos por las deshidrogenasas citosólicas y las rutas oxidativas mitocondriales vuelve a oxidarse por los complejos enzimáticos unidos en la membrana interna.  Se ensamblan en cinco complejos multiproteicos, denominados I,II,III,IV y V.

El Complejo I y el complejo II reciben electrones de la oxidación del NADH y del succinato, respectivamente, y los pasan a un trasportador electrónico lipídico, la coenzima Q, que se desplaza libremente a través de la membrana. El complejo III cataliza la transferencia de electrones desde la forma reducida de la coenzima Q al citocromo c, un transportador electrónico proteico que también puede desplazarse dentro del espacio intermembrana. Por último, el complejo IV cataliza la oxidación del citocromo c con la reducción del Oxígeno a agua. La energía liberada por estas reacciones exergónica crea un gradiente de protones a través de la membrana interna, al bombearse los  protones desde la matriz hacia el espacio intermembrana. Los protones vuelven a entrar posteriormente en la matriz a través de un canal específico en el complejo V. La energía liberada por este proceso exergónica impulsa la síntesis endergónica de ATP a partir de ADP. (Bioquímica 4ta Edición: Christopher K. Mtahews… #1)

Los transportadores de electrones actúan en complejos multienzimáticos.

Los transportadores de electrones de la cadena respiratoria están organizados en complejos supramoleculares incrustados en  membranas que se pueden separar físicamente. El tratamiento suave de la membrana mitocondrial interna con detergentes permite la resolución de cuatro complejos distintos de transportadores electrónicos, siendo cada uno de ellos capaz de catalizar la transferencia de electrónica a través de una porción de la cadena.

Resolución de los complejos funcionales de la cadena respiratoria. Se elimina primero la membrana mitocondrial externa por tratamiento con detergente de digitonina y se obtienen fragmentos de la membrana interna por rotura osmótica de la mitocondria, disolviéndose suavemente los fragmentos en un segundo detergente. La mezcla resultante de proteínas de la membrana interna se resuelve mediante la cromatografía de intercambio iónico en varios complejos I al IV de la cadena respiratoria, cada uno con composición proteica distintiva. Los complejos catalizan transferencias entre dadores: NADH y succinato, Transportadores intermedios: Q y citocromo c  y O2.                       

Los complejos I y II catalizan la transferencia de electrones a la ubiquinona a partir de dos dadores electrónicos: NADH (complejo I)  y succinato (complejo II).  El complejo III transporta electrones desde la ubiquinona reducida al citocromo c, y el complejo IV completa la secuencia transfiriendo electrones desde los citocromos c al O₂.

Complejo I: NADH hasta ubiquinona

Complejo I también llamado NADH: ubiquinona oxidorreductasa, es un enzima enorme, está compuesto por 42 cadenas polipeptídicas diferentes, entre las que se encuentra una flavoproteína que contiene FMN (flavín mononucleotido) y como mínimo 6 centros ferro-sulfurados. La microscopia electrónica de alta resolución muestra que el complejo I tiene forma de L, con un brazo L en la membrana y el otro prolongándose hacia la matriz.

El complejo I cataliza dos procesos   simultáneos forzosamente acoplados:

 1. Transferencia exergónica hacia la ubiquinona  de un ion hidruro                                                                                              del NADH y un protón de la matriz.  Expresado por

NADH+ H + Q ---------- NAD + QH₂ 

2. Transferencia  endergónica de 4 protones de la matriz hacia el espacio intermembrana.              

El complejo I es una bomba de protones impulsada por la energía de la transferencia electrónica y la reacción que cataliza es vectorial (mueve los protones en una dirección especifica desde una localización). La matriz que carga negativamente con la salida de protones, hacia otra el espacio intermembrana que se carga postivamente.   La localización de los protones P: para la cara positiva de la membrana interna (el espacio intermembrana) y N para la cara negativa (la matriz).

El amital un barbiturato, la rotenona  de producto vegetal utilizado frecuentemente como insecticida y el antibiótico piericidina A inhiben el flujo electrónico desde los centros ferro-sulfurados del complejo I a la ubiquinona, con el consecuente bloqueo global del proceso de la fosforilación oxidativa.  

El ubiquinol (QH₂ la forma reducida)  difunde por la membrana mitocondrial interna desde el complejo I al complejo III, donde se oxida a Q en un proceso acompañado de la salida de H⁺ hacia el exterior.   

Complejo II: Succinato a ubiquinona

El complejo II bajo un nombre diferente: succinato deshidrogenasa. Es el único enzima del ciclo del ácido cítrico ligado a membrana. Aunque más pequeño y más sencillo que el complejo I, contiene cinco grupos prostéticos de dos tipos y cuatro subunidades proteicas diferentes.

 Las subunidades C y D son proteínas integrales de membrana, cada una de ellas con tres hélices transmembrana. Contienen un grupo hemo (hemo b) y un sitio de unión para la ubiquinona, que es el aceptor final de electrones en la reacción catalizada por el complejo II. Las subunidades A y B se extienden hacia la matriz; contienen tres centros 2Fe-2S, FAD unido y un sitio de unión para el sustrato succinato. La ruta de transferencia de electrones desde el sitio de unión del succinato al FAD, y a continuación a través de los centros Fe-S hasta la unión de Q.

Otros sustratos de las deshidrogenasas mitocondriales también pasan electrones  a la cadena respiratoria a nivel de la ubiquinona, pero no a través del complejo II. El primer paso en la B-oxidación de los acil graso-CoA, catalizado por la flavoproteína acil-CoA deshidrogenasa, implica la transferencia de electrones electrones desde el sustrato al FAD de la deshidrogenasa y a continuación a la flavoproteína transferidora de electrones ETF que a su vez, pasa sus electrones a la ETF: ubiqinona oxidorreductasa. Este enzima pasa electrones  a la cadena respiratoria al reducir la ubiquinona. E glicerol 3-fosfato, formado tantoa partir del glicerol liberado en la hidrolisis del triacilglicerol como de la reducción de la dihidroxiacetona fosfato en la glucolisis, es oxidado por la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa. Este enzima es una flovoproteína localizada en la cara externa de la membrana mitocondrial interna y  al igual que la succinato deshidrogenasa, canaliza electrones hacia la cadena respiratoria, reduciendo la ubiquinona. El efecto de cada uno de los de estos enzimas transferidores de electrones es contribuir a la reserva de ubiquinona reducida. El QH2 formado en todas estas reacciones es reoxidado por el complejo III. (Nelson L. David, Cox M. Michael,Lehninger… #2 )

COMPLEJO III: Ubiquinona a citocromo c

También llamado complejo citocromo bc1 o ubiquinona: citocromo c oxidorreductasa, acopla la transferencia de electrones desde el ubiquinol (QH2) al citocromo c con el transporte vectorial de protones de la matriz al espacio intermembrana. La determinación de la estructura completa de este gran complejo y del complejo IV por cristalografía de rayos x marco un nuevo hito en el estudio de la transferencia de electrones mitocondriales.

Este complejo es un dímero de monómeros idénticos, cada uno constituido por 11 subunidades deferentes.

(a)   Estructura del monómero. El núcleo funcional consta de tres subunidades: el citocromo b (en verde) con sus dos hemos (bH y bL en rojo claro), la proteína ferro-sulfatada de Rieske (purpura) con sus dos centros 2Fe-2S (amarillo) y el citocromo c1 (azul) con su hemo (rojo).

(b)   Unidad dimérica funcional. El citocromo cq y la proteína ferro-sulfurada de Rieske se proyectan la superficie P y pueden interaccionar con el citocromo c del espacio intermembrana.

El complejo presenta dos sitios de unión diferenciados a la ubiquinona, QN y QP, son los sitios de inhibición por dos fármacos que bloquean la fosforilación oxidativa.

La estructura dimérica es esencial para la función del complejo III.

El complejo III funciona como una bomba de protones, debido a la orientación de los complejos, los protones producidos cuando se oxida el UQH2 a UQ se liberan al espacio intermembrana produciendo una diferencia de concentración de protones transmembrana, es decir, un gradiente de protones.

COMPLEJO IV: citocromo c a O2

También llamado Citocromo oxidasa, es el último paso de la cadena respiratorio y transporta electrones desde el citocromo c al oxigeno molecular, reduciéndolo a H2O.

Es una enzima muy grande (13 subunidades) de la membrana mitocondrial interna.

Las bacterias contienen una forma mucho más sencilla con solo tres o cuatro subunidades, pero siguen siendo capaces de catalizar tanto la transferencia de electrones como el bombeo de protones.

Contiene citocromos a y a3.

Están formados por dos grupos hemos unidos a diferentes regiones de la mima proteína, por lo que son, espectral y funcionalmente distintos.

La citocromo oxidasa contiene dos iones de cobre (CuA y CuB) que son importantes para la transferencia de electrones al O2.

Esta enzima ha evolucionado para llevar a cabo la reducción por 4 electrones de O2 sin generar intermedios incompletamente                                             reducidos como radicales libres, ya que son especies muy reactivas que dañarían los componentes celulares.

Este complejo funciona como una bomba de protones que contribuye a la fuerza protón-motriz.

Fuente bibliográfica

1.      Bioquímica 4ta Edición: Christopher K. Mtahews, K. E. Van Holde, Dean R. Appling, Sepencer J. Anthony-Cahill. Editorial PEARSON EDUCACION, S.A., Madrid, 2013. (Páginas de la 626 a 650)

2.       Nelson L. David, Cox M. Michael,Lehninger. Principios de Bioquímica, cuarta edición. Fosforilación  oxidativa y fotofosforilacion pag. 696-720

Estructura de las proteínas

Estructura de las proteínas

La estructura primaria es la forma de organización más básica de las proteínas. Este tipo de estructura de las proteínas está determinada por la secuencia de aminoácidos de la cadena proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados por medio de enlaces peptídicos. Las cadenas laterales de los aminoácidos se extienden a partir de una cadena principal.

La estructura secundaria de las proteínas es el plegamiento regular local entre residuos aminoacídicos cercanos de la cadena polipeptídica. Este tipo de estructura de las proteínas se adopta gracias a la formación de enlaces de hidrógeno entre los grupos carbonilo (-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos involucrados en las uniones peptídicas de aminoácidos cercanos en la cadena. Estos también se los encuentra en forma de espiral aplana.

·         Hélice alfa: En esta estructura la cadena polipeptídica se desarrolla en espiral sobre sí misma debido a los giros producidos en torno al carbono beta de cada aminoácido. Esta estructura se mantiene gracias a los enlaces de hidrógeno intracatenarios formados entre el grupo el grupo -C=O del aminoácido "n" y el -NH del "n+4" (cuatro aminoácidos más adelante en la cadena). Un ejemplo particular es la Hélice de colágeno: una variedad particular de la estructura secundaria, característica del colágeno, proteína presente en tendones y tejido conectivo.Existen otros tipos de hélices: Hélice 3₁₀ (puentes de hidrógeno entre los aminoácidos "n" y "n+3") y hélice Π (puentes de hidrógeno entre los aminoácidos "n" y "n+5"), pero son mucho menos usuales.

·         Hoja plegada beta: Cuando la cadena principal se estira al máximo que permiten sus enlaces covalentes se adopta una configuración espacial denominada cadena beta. Algunas regiones de proteínas adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre sí estableciendo uniones mediante enlaces de hidrógeno intercatenarios. Todos los enlaces peptídicos participan en estos enlaces cruzados, confiriendo así gran estabilidad a la estructura. La forma en beta es una conformación simple formada por dos o más cadenas polipeptídicas paralelas (que corren en el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en direcciones opuestas) y se adosan estrechamente por medio de puentes de hidrógeno y diversos arreglos entre los radicales libres de los aminoácidos. Esta conformación tiene una estructura laminar y plegada, a la manera de un acordeón.

·         Giros beta: Secuencias de la cadena polipeptídica con estructura alfa o beta, a menudo están conectadas entre sí por medio de los llamados giros beta. Son secuencias cortas, con una conformación característica que impone un brusco giro de 180 grados a la cadena principal de un polipeptido.

Estructura Terciaria 

·         ·         La estructura terciaria de una proteína está generalmente conformada por varios tramos con estructuras secundarias distintas. En cuanto a los niveles de la estructura de las proteínas, en la estructura terciaria generalmente los aminoácidos apolares se sitúan hacia el interior de la proteína y los polares hacia el exterior, de manera que puedan interactuar con el agua circundante. En el caso de proteínas integrales de membrana, los aminoácidos hidrofobicos quedan expuestos en el interior de la bicapa lipídica. Por tanto, este tipo de estructura es la que le da a la proteínas sus particularidades físicoquímicas como ser la polaridad o apolaridad de la molécula.

Estructura Cuaternaria 

En cuanto a los niveles de la estructura de las proteínas, puede tener de forma más amplia que lo normal. Comprende la gama de proteínas oligoméricas, es decir aquellas proteínas que constan con más de una cadena polipéptida, en la cual además puede existir un comportamiento de alosterismo según el método concertado de Jacques Monod.

La estructura cuaternaria deriva de la conjunción de varias cadenas aminoacidas que gracias a su unión realizan el proceso de la disjunción, dando así un resultado favorable ante las proteínas ya incrementadas. A través de la organización proteica cuaternaria se forman estructuras de gran importancia biológica como los microtúbulos, microfilamentos, capsómeros de virus y complejos enzimáticos. También las fibrillas colágenas encontradas en el espacio extracelular del tejido conjuntivo están constituidas por la agregación de cadenas polipeptídicas de tropocolágeno.

En general, la estructura cuaternaria da la función de la proteína, pero hay ejemplos de las proteínas activas fuera de su complejo cuaternario. Arreglos de subunidades pueden conferir en el complejo cuaternario o punto de eje de simetría, pero esto no es obligatorio.

El alosterismo trata de regulación enzimática de las propiedades de una proteína multimérica. En cuanto a la estructura cuaternaria, el alosterismo puede ser captado como consecuencia del movimiento relativo de un monómero en las propiedades multiméricas. La Hemoglobina proporciona un ejemplo bien estudiado, pero no es el único.

Despeje de KI (competitiva, no competitiva y acompetitiva)