Laboratorio
de Bioquímica
Fecha de entrega: miércoles 16 de octubre de 2013.
Introducción
Las enzimas están
en el centro de todos los procesos bioquímicos. Actuando en secuencias
organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas en las que se degradan
moléculas de nutrientes, se conserva y transforma la energía química y se fabrican las
macromoléculas biológicas a partir de precursores sencillos. A través de la
acción de las enzimas reguladoras los sistemas enzimáticos se coordinan de un
modo muy eficaz, permitiendo una integración armoniosa de la multitud de actividades metabólicas
diferentes que son necesarias para la vida,(1) en donde influyen algunas de las
propiedades catalíticas de las enzimas y por ende su actividad reciben la
influencia de numerosos factores que deben ser controlados y optimizados en su
totalidad si se desea que las mediciones de la actividad enzimática tengan
sentido y sean reproducibles. Entre estos factores figuran las magnitudes
físicas (temperatura, presión), las propiedades químicas de la solución (valor
del pH, fuerza iónica) y la concentración de los sustratos, cofactores e
inhibidores mas importantes.(2) los cuales llegan a tener impacto en la
velocidad de la reacción en donde
decimos que es el cambio presente en la cantidad (moléculas) de materiales
iníciales o de productos finales por unidad
de tiempo; la velocidad llega
incrementarse por la actividad de la
enzima al comportarse como catalizador( aumenta la velocidad de la reacción
química sin presentar cambios durante el proceso), uniéndose temporalmente de
forma covalente a la molécula.(3)
Objetivo
Observar y analizar el
comportamiento enzimático de acuerdo a
la intervención de factores como el pH,
temperatura, concentración de sustrato, concentración enzimática.
Metodología
Solución amilasa
La amilasa utilizada fue: α-amilasa.
El stock enzima utilizado
fue: 10 mg/100 mL ~ 4.40 mL.
El solin de trabajo fue de:
10 mL stock+10 mL reg. Fosfatos 0.02 M con pH 7.
Efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimática
Se numeraron 7 tubos de ensaye para después agregar a
cada uno de estos soluciones diferentes.
Preincubación
durante 5 minutos
Al
tubo de ensaye 1(que fue nuestro tubo “testigo negativo”t[-]), a los tubos de
ensaye 2, 3, 4, 5, 6 y 7 se les agregaron a cada uno de ellos: 0.5 mL de
sustrato de almidón (8 mg/mL), 1.5 mL de solución reguladora de fosfatos (0.02
M y pH 7) y 3 mL de agua destilada, agitando a cada uno de estos muy bien.
Posteriormente se preincubaron a cada uno de los tubos a diferentes
temperaturas durante 5 minutos; al tubo 1 a 20°C, al tubo 2 a 0°C (vertiéndolo
en un vaso de precipitado de 250 mL con hielo), al tubo 3 a 20 °C, al tubo 4 a
40°C, al tubo 5 a 50°C, al tubo 6 a 60 °C y al tubo 7 a 92°C.
Incubación durante
15 minutos
Después
de haber preincubado durante 5 minutos y a 20°C al tubo de ensaye 1 (t[-]), se
le agregaron 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico y 0.5 mL de la solución de la
enzima agitándolo muy bien, donde nuevamente se incubo a una temperatura de
20°C durante 15 minutos. Posteriormente
a los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5, 6 y 7 con sus soluciones y temperaturas correspondientes;
se le agregaron a cada uno de estos tubos 0.5 mL de la solución de la enzima
agitándolos muy bien, donde después se incubaron durante 15 minutos a
temperaturas diferentes; al tubo de ensaye 2 a 0°C, al tubo de ensaye 3 a 20°C, al tubo de ensaye 4 a 40°C, al tubo
de ensaye 5 a 50°C, al tubo de ensaye 6 a 60°C y al tubo de ensaye 7 a 92°C.
Baño maría
Posteriormente de
haber incubado durante 15 minutos al tubo de ensaye 1 con sus soluciones y
temperatura correspondiente se puso a baño maría durante 10 minutos.
Así
también, después de haber incubado durante 15 minutos con sus soluciones y
temperaturas correspondientes a los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5, 6 y 7 se les
agrego 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico agitándolos muy bien, posteriormente
se pusieron a baño maría durante 10 minutos.
Enfriamiento
Después de haber pasado los 10 minutos a baño maría;
a cada uno de los tubos de ensaye se les enfrió al chorro de agua donde después
de ello se secaron con un papel.
Lectura de
absorbancias
Posteriormente
cuando los tubos se enfriaron; se prepararon las celdas para su lectura en el
espectrofotómetro , siendo como blanco (para ajustar a cero) el tubo de ensaye
1. Así pues, a cada una de las soluciones diferentes se leyeron a 540 nm.
Efecto del pH sobre
la actividad enzimática
Se numeraron 6 tubos de ensaye para después agregar a
cada uno de estos soluciones diferentes.
Preincubación
durante 5 minutos
A los
tubos de ensaye (tubo 1: “testigo
negativo” t[-]) se les agregaron a cada uno de ellos: 0.5 mL de sustrato de
almidón (8 mg/mL), 4 mL de solución reguladora de fosfato (0.02 M)y 4 mL de NaCl(0.2
M) con pH diferentes para cada tubo así, el tubo de ensaye 1 con un pH de
7, el tubo de ensaye 2 con un pH de 5, el tubo de ensaye 3 con un pH 6, el tubo de ensaye 4 con un pH 7, el
tubo de ensaye 5 con un pH 8 y el tubo de ensaye 6 con pH 9, posteriormente se
agito muy bien a cada uno de los tubos. Inmediatamente se preincubaron a 40°C a
todos los tubos durante 5 minutos.
Incubación durante
15 minutos
Después
de haber preincubado durante 5 minutos y a 40°C al tubo de ensaye 1 (t[-]), se
le agrego 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico y 0.5 mL de la solución de la
enzima agitándolo muy bien, donde nuevamente se incubo a una temperatura de
40°C durante 15 minutos.
De
igual manera, posterior a la preincubación a los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5 y 6
con sus soluciones y temperatura correspondientes; se le agregaron a cada uno
de estos tubos 0.5 mL de la solución de la enzima agitándolos muy bien, donde
después se incubaron durante 15 minutos a una temperatura de 40°C.
Baño maría
Posteriormente,
a la incubación durante 15 minutos con sus soluciones y temperatura
correspondiente a los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5 y 6 se les agrego 1 mL de
ácido 3,5-dinitrosalicílico agitándolos muy bien, donde posteriormente se
pusieron a baño maría durante 10 minutos.
Enfriamiento
Después de haber pasado los 10 minutos a baño maría;
a cada uno de los tubos de ensaye se les enfrió al chorro de agua.
Lectura de
absorbancias
Posteriormente
cuando los tubos se enfriaron; se agregó un poco de cada solución de los
diferentes tubos de ensaye al tubo que se lee en el espectrofotómetro, siendo
como blanco (para ajustar a cero) el tubo de ensaye 1. Así pues,cada una de las
soluciones diferentes de los tubos de ensaye se les leyó a 540 nm.
Efecto de la
concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática
Se
numeraron 9 tubos de ensaye para después agregar a cada uno de estas soluciones
diferentes.
Preincubación
durante 5 minutos
Al
tubo de ensaye 1 (“testigo negativo” t[-]), se le agregaron 7.5 mL de sustrato
de almidón (8 mg/mL) y 0.5 mL de solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH
7).
Al
tubo de ensaye 2, se le agregaron 0.5 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL) y 7mL
de solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7).
Al
tubo de ensaye 3: 1 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL) y 6.5 mL de solución
reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7).
Al
tubo de ensaye 4: 2 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL) y 5.5 mL de solución
reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7).
Al
tubo de ensaye 5: 3mL de sustrato de
almidón (8 mg/mL) y 4.5 mL de solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7).
Al
tubo de ensaye 6: 4 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL) y 3.5 mL de solución
reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7).
Al
tubo de ensaye 7, se le agrego 5 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL) y 2.5 mL
de solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7).
Al
tubo de ensaye 8, se le agrego 6 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL) y 1.5 mL
de solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7).
Al
tubo de ensaye 9, se le agrego 7.5 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL) y 0.5 mL
de solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7).
Las
soluciones anteriores fueron preincubadas a 40°C por 5 minutos.
Incubación durante
15 minutos
Después
de haber preincubado durante 5 minutos y a 40°C al tubo de ensaye 1 (t[-]), se
le agrego 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico y 0.5 mL de la solución de la
enzima agitándolo muy bien, donde nuevamente se incubo a una temperatura de
40°C durante 15 minutos.
Así
también, posterior a la preincubación, a
los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 con sus soluciones y temperatura
correspondientes; se le agregaron a cada uno de estos tubos 0.5 mL de la
solución de la enzima agitándolos muy bien, donde después se incubaron durante
15 minutos a una temperatura de 40°C.
Baño maría
Posteriormente
al testigo negativo con sus soluciones y temperatura correspondiente se puso a
baño maría durante 10 minutos.
Por
consiguiente, a los tubos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 se les agregaron 1 mL de
ácido 3,5-dinitrosalicílico agitándolos muy bien, donde posteriormente se pusieron
a baño maría durante 10 minutos.
Enfriamiento
se enfriaron los tubos a chorro de agua.
Lectura de
absorbancias
Posteriormente
cuando los tubos se enfriaron; se agregó un poco de cada solución a las
diferentes celdas, se utilizó como blanco (para ajustar a cero) el tubo de
ensaye 1. Así pues, cada una de las soluciones se leyeron a 540 nm.
Efecto de la
concentración de enzima sobre la velocidad de una reacción enzimática
Al
testigo negativo (t[-]) se le agregaron 0.5 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL),
1 mL de solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7) y 3.4 mL de agua
destilada.
Al
tubo de ensaye 2, se le añadieron 0.5 mL
de sustrato de almidón (8 mg/mL), 1 mL de solución reguladora de fosfato (0.02
M y pH 7) y 4.9 mL de agua destilada.
Al
tubo de ensaye 3, se le agregaron 0.5 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL), 1 mL
de solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7) y 4.8 mL de agua destilada.
Al
tubo de ensaye 4, fueron añadidos 0.5 mL
de sustrato de almidón (8 mg/mL), 1 mL de solución reguladora de fosfato (0.02
M y pH 7) y 4.6 mL de agua destilada.
Al
tubo de ensaye 5, se añadieron 0.5 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL), 1 mL de
solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7) y 4.2 mL de agua destilada.
Al
tubo de ensaye 6, se le agrego 0.5 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL), 1 mL de
solución reguladora de fosfato (0.02 M y pH 7) y 3.4 mL de agua destilada.
Preincubación
durante 5 minutos
Se
preincubaron los tubos anteriores a un temperatura de 40°C durante 5 minutos.
Incubación durante
15 minutos
Después
de haber preincubado durante 5 minutos y a 40°C al tubo de ensaye 1 (t[-]), se
le agrego 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico y 1.6mL de la solución de la
enzima agitándolo muy bien, donde nuevamente se incubo a una temperatura de
40°C durante 15 minutos.
Así
también, al tubo de ensaye 2 se le agregó 0.1 mL de la solución de la enzima.
Al
tubo de ensaye 3 se le añadieron 0.2 mL de la solución de la enzima.
Al
tubo de ensaye 4 se le agregó 0.4 mL de la solución de la enzima.
Al
tubo de ensaye 5 se le agregó 0.8 mL de la solución de la enzima.
Al
tubo de ensaye 6 se le agregó 1.6 mL de la solución de la enzima.
Finalmente
se agitaron perfectamente todos los tubos y se incubaron a la misma temperatura
antes descrita durante 15 minutos.
Baño maría
Posteriormente
de haber incubado durante 15 minutos al tubo de ensaye 1 con sus soluciones y
temperatura correspondiente se puso a baño maría durante 10 minutos.
Por
el contrario, después de haber sido
incubados durante 15 minutos con sus soluciones y temperatura correspondientes
a los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5 y 6 se les agregaron 1 mL de ácido
3,5-dinitrosalicílico y se elevó la temperatura nuevamente a baño María.
Enfriamiento
Después de haber pasado los 10 minutos a baño maría;
a cada uno de los tubos de ensaye se les enfrió al chorro de agua.
Lectura de
absorbancias
Posteriormente
cuando los tubos se enfriaron; se agregó un poco de cada solución de los
diferentes tubos de ensaye a las celdas, utilizando nuevamente el siendo como
blanco (para ajustar a cero) el tubo de ensaye 1. Así pues, cada una de las
soluciones diferentes de los tubos de ensaye se les leyó a 540 nm.
Resultados
Con la curva estándar
proporcionada se obtuvo [AR]= M*Abs+I
|
Tabla 1. Efecto
de la temperatura sobre la actividad enzimática
|
|
Tubo
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
|
Densid. optica (Abs)
|
0
|
0,035
|
0,221
|
0,249
|
0,159
|
0,141
|
0,173
|
|
[AR]
|
46,5066
|
59,3218
|
127,426
|
137,678
|
104,725
|
98,1339
|
109,851
|
|
Tabla 2. Efecto
del pH sobre la actividad enzimática
|
|
Grafica 1. Efecto de la temperatura sobre la actividad
enzimática
|
|
Tubo
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
|
Densidad óptica (Abs)
|
0
|
0,009
|
0
|
0,003
|
0,03
|
0,016
|
|
[AR]
|
46,507
|
49,802
|
46,507
|
47,605
|
57,491
|
52,365
|
|
Grafica 2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática
|
|
Tabla 3. Efecto
de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática
|
|
Tubo
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
|
Densida optica (Abs)
|
0
|
(-)0,0335
|
(-)0,039
|
(-)0,047
|
(-)0,0435
|
(-)0,041
|
0
|
0,0035
|
0,0045
|
|
[AR]
|
46,507
|
34,241
|
32,227
|
29,297
|
30,579
|
31,494
|
46,507
|
47,788
|
48,154
|
|
Determinación de los valores KM y VMAX para
el sistema, en estas condiciones: KM=____mg de almidón/L y VMAX=___
[AR]/min.
VMAX=(48.1542mg/mL)/15min
= 3.21028 [AR]/min
KM=
= 8000 mg de almidón/L
|
|
Grafica 3. Efecto de la concentración del sustrato sobre
la actividad enzimática
|
Discusión
La amilasa es una
enzima que ayuda a dirigir los carbohidratos o almidones, siendo esta enzima la
que se utilizó para el análisis de los factores externos que alteran la
actividad enzimática; la temperatura óptima de dicha enzima es de 50 a 55°C,
pero su reacción parece satisfactoria a 37°C (6). En la tabla y gráfica número
1 podemos observar que se obtuvo una
mayor concentración de azucares reductores, por lo tanto una mayor actividad
enzimática a una temperatura de 40°C. El aumento de la temperatura incrementa
el movimiento de las cadenas de aminoácidos y de los grupos laterales, y por
tanto, aumenta la fuerza y frecuencia de las colisiones entre las moléculas y
las enzimas que las rodean (9). Dicho aumento de las colisiones presentes entre
las moléculas de la enzima y el sustrato favorecen la reacción catalizada
debido al contacto entre ellos. Al presentar temperaturas elevadas, estas
colisiones adquieren un comportamiento “violento”, siendo capaces de romper los
puentes de hidrogeno y las fuerzas de van der Waals, que son enlaces
relativamente débiles, logrando disminuir la actividad enzimática. De acuerdo a
los resultados observados en la gráfica, la actividad enzimática dentro de los 20
a 40°C es aceptable, al aumentar la temperatura dicha actividad decrece
hasta el punto de desnaturalizar la enzima, con lo que podemos observar que
efectivamente la temperatura es un factor importante en la desnaturalización de
las proteínas, de acuerdo a lo obtenido a partir del punto 5 al 7 (en el eje
x), con una temperatura máxima de aproximadamente
92°C.
El segundo factor
que analizamos es pH como se observa en
tabla 2 y grafica 2, en donde los
cambios del mismo pueden alterar al estado de ionización de las cadenas
laterales de los aminoácidos ácidos y básicos, en donde estos cambios pueden
afectar a la afinidad de la enzima por el sustrato, si las cargas se ven
alteradas las cargas de los aminoácidos que
participan en la formación de interacciones no covalentes entre la
enzima y el sustrato para formar complejo ES. También se puede alterar
la etapa de transformación del sustrato
en producto, si se modifican los residuos catalíticos. (5) En las enzimas el pH
óptimo, es decir el pH en el cual la actividad es máxima, habitualmente se
aproxima al pH de las células (alrededor de 7), aun que existen excepciones.
(2) La forma acampanada de la curva de actividad pH como se observa en la grafica 2 se
produce porque los residuos de aminoácidos con grupos ionizables en la cadena
lateral son esenciales para la catálisis. (2) efectuada por la hidrolasa, la
enzima digestiva específica para la hidrólisis del almidón, que fue denominada
en un comienzo como diatasa, en la actualidad se denomina amilasa, tiene un pH óptimo de 6.9-7.2, pero varía de 5.5-6.5 con diferentes sustratos y es inestable por
debajo del pH 4.5. (6) de acuerdo a nuestra tabla numero dos podemos observar
que en el tubo 5 se alcanza la mayor concentración molar de azucares reductores, de igual manera
si analizamos la grafica 2 observamos
que la formación de la campana en el punto 5 (eje de las X) y de acuerdo a la preparación de nuestras muestras el tubo mantenía un pH de 8, por lo que
podemos ver que nuestros resultados
no concuerdan con la bibliografía, por lo que el equipo atribuye
esa variación algunas malas
técnicas de trabajo, como un mal pipeteo, descuidos con los tiempos de
incubación de igual forma con las temperaturas de los mismos.
El tercer factor
fue la actividad del sustrato, en donde
se midió la actividad de la enzima
usando concentraciones crecientes de sustrato, se llega ha observar un comportamiento especial llamado cinética de Michaelis
–Menten, en donde a bajas
concentraciones de sustrato la velocidad de reacción enzimática es directamente
proporcional a la concentración a la concentración del mismo, siendo una reacción
de primer orden. A mediana concentraciones de sustrato, la velocidad de la
reacción enzimática ya no es
directamente proporcional a la cantidad del sustrato, aunque sigue
aumentando la velocidad, lo que corresponde a una reacción de orden mixto. A elevadas
concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción enzimática ya no
aumenta mas, por más sustrato que se le adicione, indicando una saturación de
la enzima con su sustrato y siendo una reacción de orden cero.(7) A medida que
aumenta la concentración de sustrato, la
velocidad inicial aumenta hasta que la enzima esta completamente saturada por
el sustrato, se obtiene una hipérbola rectangular; como se observa en la grafica 3, a
partir del punto 5 hasta 9 (eje de las
x) La velocidad alcanza un límite máximo en el punto en que todos los centros
asequibles están saturados, es decir en el tubo nueve de acuerdo ala tabla numero 3 (8). En donde obtuvimos la velocidad máxima. Si comparamos
la grafica numero 3 con las graficas analizadas en la bibliografía vemos
que al inicio se muestra como si las concentración fueran grandes como se muestra en la tabla 3 los tubos 1,2 y
3 presentan este comportamiento, el tubo
uno fue nuestro blanco en el espectrofotómetro, por lo que el equipo considero a partir del tubo 2; y desde del tubo 4 al tubo 9 vemos que cumple con la teoría, sin embargo los puntos
anteriores nos indican que de igual
forma que en el factor del pH nuestra mala técnica nos llevo a obtener
variantes en nuestros resultados de
acuerdo a las citas bibliográficas realizadas; (mal pipeteo, y descuido con los tiempos de incubación y
baño maría en donde se comenzaron a caramelizar).
En el efecto de la
concentración de enzima sobre la velocidad, no se muestran resultados ya que no
logramos leer en el espectrofotómetro
debido a que el tiempo se nos agoto, podemos decir que la mala organización como equipo y como equipos
presentes en el laboratorio se hizo
presente ante solo un espectrofotómetro
presente, si nuestra técnica hubiera
sido la correcta y no se hubiera presenciado errores al seguir la metodología nuestros
resultados debieron de haber sido muy
similar a los procesos que indica la bibliografía, de tal forma que en este caso debió de haber pasado (lo siguiente…….busque
este efecto y transcríbanlo, y
creo que ya quedaría :/ bn analisenlo)
Conclusión
Al término de la práctica
se observó que los diferentes parámetros utilizados en
cada uno de los análisis influyeron de
gran forma en la actividad enzimática, por lo tanto, el objetivo fue cumplido.
Bibliografía:
(1)David L. Nelson,
Michael M. Cox; cuarta edición; principios de bioquímica, Lehninger;pag.190
(2)Koolman*Rohm; 3ra edición; editorial medica
panamericana; Bioquímica texto y atlas;
pag. 94
(3)Thomas M.
Devlin; Editorial Reverte, S.A.; cuarta edición; Bioquímica, libro de texto con
aplicaciones clínicas; pag.414
(5) Feduchi,
Blasco, Romero, Yañez; Editorial medica panamericana; Bioquimica conceptos esenciales; pag.148
(6)MacFaddin;
editorial medica panamericana; 3ra edicion; pruebas bioquímicas para
identificación de bacterias;pag.388
(7)M. en C. Ofelia
Grajales Muñiz; 2005;Apuntes de bioquímica vegetal, bases para su aplicación
fisiología; pag.45
(8) Thomas M.
Devlin; Editorial Reverte, S.A.; cuarta edición; Bioquímica, libro de texto con
aplicaciones clínicas; pag.421
(9) Fornaguera
Jaime; Gómez Georgina. EUNED. Bioquímica: la ciencia de la vida. Pag. 65
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